أبحاث علمية بجامعة دمشق حول إنتاج البروتياز من فطر Rhizomucor miehei كبديل للمنفحة التقليدية

يُعدّ البروتياز أحد أهم الأنزيمات الصناعيَّة نظراً لتطبيقاته الواسعة في صناعة المُنظِّفات، والجلديات، والصناعات الدوائية، بالإضافة إلى الصناعات الغذائيَّة كصناعات الألبان والخبز وتطرية اللحوم. وتُمثِّل صناعة الأجبان التطبيق الرئيس للبروتياز في صناعات الألبان. وتتمثَّل الوظيفة الأساسيَّة للبروتياز في صناعة الأجبان في البدء بعملية تخثُّر الحليب، من خلال الفصل السريع وعالي التخصُّص للبروتينات الرئيسة في الحليب (الكازئين). وتُعدّ منفحة العجول الشكل الأكثر استخداماً لأنزيمات تخثُّر الحليب، ويتمّ استخلاصها من المعدة الرابعة للعجول الرضيعة.

أدَّى الإنتاج العالمي المتزايد للأجبان بالارتباط مع نقص إنتاج المنفحة نتيجة عدم الرغبة في ذبح العجول قبل الفطام إلى ارتفاع سعر المنفحة التقليدية، ما حفَّز البحث عن أنزيمات لتخثُّر الحليب من مصادر بديلة. وقد تمَّ البحث في إمكانيّة استخدام العديد من المصادر الحيوانيَّة والنباتيَّة، والميكروبية كبدائل للمنفحة، التي أثبتت في معظمها عدم مناسبتها لصناعة الأجبان بسبب الفعاليّة المرتفعة لتحلُّل البروتين. وقد أظهر البروتياز من فطرRhizomucor miehei  نتائج واعدة للاستخدام، نظراً لخواصه المماثلة لأنزيم المنفحة، والجودة المرتفعة للجبن المنتج.

وقد أجريت دراسة في جامعة دمشق حول إنتاج البروتياز من عزلة محلية من فطر Rhizomucor miehei باستخدام تخمُّر الحالة الصلبة. إذ تمَّ العمل على أمثلة ظروف الإنتاج باستخدام منهجية الاستجابة السَّطحيَّة بعد الغربلة الأوَّليّة لمكوِّنات وسط التخمُّر. وقد تمثَّلت الظروف المثلى للإنتاج في اختيار نخالة القمح كركازة بمحتوى رطوبي %80 ومُدعَّمة بالكازئين بنسبة 1.33%، وضَبط الـ  pHالابتدائي عند 6.31، والتحضين عند درجة حرارة 41.1 ̊C، لمُدَّة 81.21 ساعة. وقد بلغت قيم نشاط التخثُّر النَّوعيّ، ونسبة نشاط التخثُّر/ النشاط الحالّ للبروتين للمستخلص الأنزيمي المُنتَج 441.90 SU/mg، و388.66 على التَّوالي.

وتشير هذه النتائج إلى القدرة العالية للفطر على إنتاج البروتياز، وتميُّز الأنزيم المُنتَج بنشاط تخثُّر نوعيّ مرتفع، وقيمة مرتفعة لنشاط تخثُّر الحليب نسبةً للنشاط الحالّ للبروتين، وهو الأمر المُفضَّل في صناعة الأجبان. كما أظهرت النتائج نجاعة استخدام منهجية الاستجابة السَّطحيَّة في أمثلة ظروف التخمُّر، والتنبّؤ بقيم المتغيِّرات.

وفي دراسة أخرى، تُعد الأولى من نوعها من حيث استخدام الأمواج الميكرويّة وإيثيل سلفونات الميثان في برامج التطفير المورثي لتحسين إنتاج البروتياز من فطر Rhizomucor miehei. استطاع الباحثون الحصول على طفرة مستقرة، فائقة للعزلة الأصل، من خلال التَّعريض للأمواج الميكرويّة (2450 MHz; 150 sec)، إذ أثبت الباحثون وجود تأثيرات غير حرارية للأمواج الميكرويّة في إحداث الطفرات فوق المستوى التلقائيّ لحدوث الطفرة. وقد أظهر البروتياز المُنتَج من الطفرة تحسُّناً بمقدار 1.98، 2.18 ضِعفاً في كلٍ من نشاط التخثُّر النَّوعيّ، ونسبة نشاط التخثُّر/ النشاط الحالّ للبروتين، على التَّوالي بالمقارنة مع أنزيم العزلة الأصل.

وفي دراسة لاحقة حول تنقية بروتياز العزلات الطبيعيَّة، والمُطفَّرة باستخدام الأمواج الميكرويّة، وتوصيفه. أثبت الباحثون تماثل الخواص الحركية والثرموديناميكية لكل من الأنزيم الطبيعي والمطفر، رغم تباين الفعالية الأنزيمية. إذ تحقَّقَ أقصى نشاط لتخثُّر الحليب عند درجة حرارة ̊C 57.5، وpH 5، وتركيز 9 g/L من كلوريد الكالسيوم.

كما تحقَّقَت أعلى قيم للنشاط الحالّ للبروتين عند درجة حرارة ̊C  57.5، وpH 4. وكانت الأنزيمات مستقرَّة في المجال الحراري 40-50 °C لمُدَّة 48 hrs، كما استقرَّت نسبياً عند الدَّرجات 60 °C و70 °C لمُدَّة 105 min و10 min على التَّوالي، وثُبِّطَت عند التَعرُّض للدرجتين السابقتين لفترات أطول. وكان الأنزيم مُستقِّراً اتجاه التغيُّر في قيم الـ pH ضمن المجال pH 3-7. وتمثَّل أثر كلوريد الصوديوم في تحفيز نشاط تخثُّر الحليب وتثبيط النشاط الحالّ للبروتين. وباستخدام تقنية الرحلان الكهربائي قُدِّرَ الوزن الجزيئي للبروتياز المُنقَّى المُنتَج من كلٍ من العزلتين الطبيعيَّة والمُطفَّرة بحوالي 39.77 kDa ، و40.62 kDa، على التَّوالي.